랩돌이 140203~08 1주차 (PCR E.coli transformation 및 E.coli culture E.coli 에서 plasmid 추출MIDI prep plasmid 를 제한효소로 잘라내기 + purification Agarose Gel 전기영동)

  이번주는 논문하나를 반정도 읽고 생물학 실험의 기본인

PCR

E.coli transformation 및 E.coli culture

E.coli 에서 plasmid 추출

plasmid 를 제한효소로 잘라내기 + purification

Agarose Gel 전기영동

을 하였습니다. 일단 집에와서 기억나는대로 정리중(나중에 실험실에서 수정 ㅜ)

(전체적으로 쓰던건 pcDNA myc Linker BuBR1 EcoRi site mutation)

-------------------------------

PCR

DNA template               1ul

Primer P.F      10pmol   1ul

          P.Rev  10pmol    1ul

nPfu forte                     1ul

dNTP 0.5mM (10x)        5ul

PCR BF (10x)              5ul

DW

--------------------------

                                 50ul

E.coli Quick transformation

자세한 조성 생각안남

competenet cell DH10B 및 plasmid

competent cell -80도 보관했던 것 얼음에서 녹이기

DNA 넣고 Ice incubation 5~30min (1ug이면 매우 충분) 

Heatshock 42도 45s

ice incubation 3min

agar plate에 streaking 후 잠시 건조 후 배양

E.coli plasmid 추출 QIAGEN MIDI prep

3000rpm 4도 30분 centrifuge 로 e.coli 가라앉히기

상층액 버리고 resuspension buffer 로 vortex, pipet으로 cell들 풀기. (RNase 포함-4도에 있음)

lysis buffer(5분안에 종료) invert로 잘 섞음.(색으로 확인 가능하면 잘 퍼지도록)

neutralization buffer invert  (cell debris 뭉치기 시작)

Ice incubation

12000RPM 4도 60min centrifuge

 column 위에 가라앉지 않는 debris 제거용으로 거즈 2번접어 깔아둠

QBT buffer로 column 적셔둠

상층액 부움

wash- QC buffer X2

elute with QF buffer

DNA precipitation with isopropanol 

12000RPM 4도 30min

상층액 부운 후 with ethanol 70% 넣고 pause 가능

120krpm 30min 4도 70% EtOH 한번더 centrifuge

genotyping DW 200ul 4도 1day --pellet 크기에 따라 양 달리한다

plasmid 를 제한효소로 잘라내기 

DNA               1ugl

EcoR1              1ul  -- DNA한 10~15분 만에 자를 수 있는 정도의 양 ---UNIT/ul

Cla 1                3ul

buffer 4 10x     5ul== 제한효소마다 다름

BSA     10x    5ul

DW                 to 50ul

------------------------

                       

-- water bath 에서 2시간

purification

PCR purification buffer 5배 넣고

column에 넣고 120krpm 1min

wash buffer 120krpm 1min

120krpm 1min

DW elution 50ul 120krpm 1min

Agarose Gel 전기영동

agarose gel만들기

agarose E 가루 0.5x TAE buffer에 녹여 농도 맞춘 후 전자렌지에서 흔들면서 끓임  200ml

약한 식힌 후(뜨거우면 EtBr 파괴) EtBr 1000분의 1

틀에 넣고 식힌다. 

전기영동 달리기

DNA Marker 로딩(냉장고에) 몇 base 짜리인지에 따라 넣는 양 다르게 로딩한다.

dye 2ul+DNA 5ul=7ul 을 로딩

달려라 달려라

UV 박스에 넣고(주걱으로 고정) 사진 찍기

--------------------------------

일단 이 정도군요. 더 자세히는 나중에 실험실에서 시간이 있으면 ㅎㅎ

근데 과연 이번주는 그렇다치고 다음주부터도 계속 써 나갈 수 있을 것인가! ㅋㅋㅋㅋㅋ